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TOP10感受态细胞转化效率高达108cfu/μg，其转化后单菌落的生长数多，比DH5 α略快相同培养时间内其菌斑略大于DH5α。适用于高效的DNA克隆和质粒扩增。能保证高拷贝质粒的稳定复制。具链霉素抗性。
基因型:
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15ΔlacX74 recA1 ara Δ 139 Δ(ara-leu) 7697galU galK rpsL (Strr) endA1 nupG
保存条件: -70℃冻存，不能反复冻融。
《求助》哪位高手经常在康体生命购买感受态细胞 ？想买二十支
用过，转化效率没什么问题，但是他家二百只起卖，没有小包装。
为什么用cacl2溶液悬浮细胞时必须轻轻悬浮
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化准备：一.材料E.coli DH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA:购买或实验室自制,eppendorf管. 二.设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪. 三.试剂 1.LB固体和液体培养基2.Amp母液 3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板. 4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板. 5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌. 6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌. 操作步骤：一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期.将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右. 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟. 2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟. 3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液. 4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年. 三、 转化 1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上. 2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟. 4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时. 同时做两个对照: 对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同.此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现. 对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落. 四、 计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数. 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下：转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 [注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化.但它们的转化效率并不一定一样.有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率.
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